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中华肝脏病杂志网络版2003网络论文·
CJH-NET001 |
脂质体介导p53基因转染对人肝癌细胞端粒酶活性影响研究
戴大英1，翟为溶1，万大方2，朱腾方1，朱虹光1
【摘要】 目的 探讨肿瘤抑制基因p53对人肝癌细胞端粒酶活性及其催化亚单位hTERT(human
telomerase reverse transcriptase, hTERT)的影响，并探讨可能的机制。方法 用脂质体介导基因转染法将Wild-type p53(wt-p53)导入端粒酶/hTERTmRNA阳性的SMMC-7721人肝癌细胞中;用RT－PCR鉴定转染效率；PCR-ELISA、TRAP-银染、原位杂交和RT-PCR法检测细胞端粒酶活性和hTERTmRNA表达;应用流式细胞仪观察细胞凋亡改变。结果 外源wt-p53基因转染后SMMC-7721细胞端粒酶活性、hTERTmRNA表达明显抑制，bcl-2蛋白表达减少,细胞呈现凋亡改变。结论 外源wt-p53基因表达可抑制人肝癌细胞端粒酶活性；端粒酶活化、hTERTmRNA表达存在p53依赖性调节途径；bcl-2可能参与p53对端粒酶/hTERT表达的影响过程。
【关键词】 基因，p53；基因转染；癌，肝细胞；端粒酶
Effect of
Lipofectin-mediated p53 gene transfection on telomerase activity in human
hepatocelluar carcinoma cell
DAI Daying,
ZhAI Weirong, WANG Dafang, et al.Department of Pathology, Medical Center
of Fudan University , Shanghai 200032, China
【Abstract】 Objective To investigate the effects of tumor suppressor gene p53 on the
activity of telomerase/hTERT in hepatocellular carcinoma (HCC) cell. Methods
Lipofectin-mediated gene transfection method was used to transfect wild-type
p53(wt-p53) into HCC-9204 which carries mutant-type p53 gene. The expression of
p53 was confirmed by Western blot. Both the telomerase activity and hTERT mRNA
expression were detected by PCR-ELISA, TRAP-silver stainning , in-situ
hybridization and RT-PCR methods. The apoptotic appearance was examined by FCM.
Results Higher telomerase activity and hTERT mRNA level were
detected in HCC-9204, and they were markedly inhibited after transfected with
wt-p53., meanwhile, decreasing level of bcl-2 protein and appearance of
apoptosis were also shown in the transfected cells. Conclusion
Over expression of the exogenous wt-p53 gene does suppress both telomerase
activity and hTERT mRNA expression in HCC cell line. There is a p53-dependent
regulatory pathway for activation and expression of telomerase/hTERT in HCC.
【Key words】 Genes, p53；gene
transfection；carcinoma, hepatocellar；telomerase
端粒酶及其催化亚单位hTERT活化表达和肿瘤抑制基因p53异常是肿瘤发生中常见的事件[1 2 3]。我们对人体材料的原位检测发现肝细胞肝癌（HCC）中hTERT表达上调与p53异常密切相关[4]，本实验在前面研究的基础上，用脂质体介导基因转染方法将人全长野生型p53基因导入端粒酶/hTERT阳性的SMMC-7721人肝癌细胞中，进一步观察wt-p53基因对HCC端粒酶/hTERT的影响作用，同时探讨其可能的机制，以期为以端粒酶为靶点的肿瘤基因治疗及p53基因肿瘤抑制的新机制提供实验依据。
材料方法
一、材料
1、细胞株 SMMC-7721人肝癌细胞由上海第二军医大学建株[5],中科院上海细胞生物研究所白旭方博士保存馈赠。HeLa
人子宫颈癌细胞，购自中国科学院上海生物细胞研究所。
2、质粒 pCMV-Script
- p53重组质粒由上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室馈赠。重组质粒全长6kb，其中人p53基因长1.8kb,克隆于真核表达载体pCMV-Script（Promega）的NotI和ApaI位点。线性化hTERT质粒DNA由北京医科大学病理系张波教授馈赠。
3、主要试剂 Telomerase PCR－ElISA 试剂盒购自宝灵曼公司；Lipofection转染试剂、RNA抽提纯化用TRIzol试剂购GIBCO公司；NotI、
ApaI及Lambda DNA/EcoRI+HindIII DNA marker购自上海生物工程公司； DL-2000 DNA Marker购自TaKara公司；
M-MLV 逆转录酶购自Promega 公司； PVDF膜购自BIO-RAD公司。
二、方法
1、细胞培养、质粒的抽提及酶切鉴定按常规方法进行。
2、脂质体介导基因转染：根据使用说明，用Lipofectin
(GIBCO BRL)转染培养的HCC-9204细胞，灭菌的重组质粒DNA和Lipofectin分别用OPTIMEM I Reduced Serum
Medium稀释，室温下静置30分钟后混合在一起再静置15分钟制成Lipofectin/DNA复合物，然后用含该复合物的无血清培养基替换细胞原培养基，培养10h；然后换用新的不含质粒的完全培养基继续培养。分别于转染后24h、48h和72h收集细胞进行各项检测指标的对比观察。
以pCMV-Script空载体质粒DNA取代重组质粒作阴性对照（质粒DNA、Lipofectin的最终浓度分别为2μg/ml和12μl/ml）。
3、端粒酶活性检测：PCR-ELISA法
按试剂盒说明操作进行。以已知端粒酶阳性的HeLa细胞抽提物作阳性对照，以HeLa细胞抽提物与RNase（1μg /μl）共同温育37℃ 20min，使端粒酶内源性RNA降解作为阴性对照。结果判定为阳性对照的吸收值应高于1.5，阴性对照吸收值应低于0.25；将样本吸收值减去阴性对照吸收值，差值高于0.2为端粒酶阳性。TRAP-银染法
参考文献[6]进行。
4、原位杂交： RNA探针标记按照地高辛RNA标记试剂盒（宝灵曼公司）操作说明进行。原位杂交步骤参照文献[4]进行，碱性磷酸酶标记，NBT/BCIP显色。RNase（20(g/ml)预处理细胞爬片作RNA阴性对照，杂交液中不加探针作空白对照。在清晰的背景上细胞浆内出现蓝紫色颗粒为阳性，阴性对照不着色。
5、RT－PCR：按试剂说明书完成RNA抽提纯化和cDNA的合成。hTERT特异性引物为[7]
LT5:5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'；LT6:5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3'； p53特异性引物[8]：
5'-CAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTAC-3
（正义）
5'-CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC-3'（反义）；内参照GAPDH特异性引物由primer
3软件设计，序列为：
上游引物
5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，
下游引物
5'-TCCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'）
PCR扩增条件：94℃
5min ，94℃ 45sec，55℃ 1min ，72℃ 90sec ，回至94℃ 45sec， 其中GAPDH和p53 扩增行27个循环 、hTERT 扩增行39个循环，72℃
4 min，4℃保存。扩增产物分别为145bp、293bp、450bp。
Western
blot：参照抗体说明书进行，鼠抗人bcl-2单克隆抗体（Santa Cruz Co.）稀释度为1:400。流式细胞仪检测参考文献进行[9]。
结 果
一、wt-p53重组质粒酶切鉴定：重组质粒经ApaI酶切后显示6.0kb片断，经NotI
/ ApaI酶切后有1.8kb插入片断释放。
二、转染前细胞端粒酶活性、hTERTmRNA表达PCR－ELISA结果显示450nm处阳性对照吸收值为1.573,阴性对照吸收值为0.069，SMMC－7721细胞吸收值为1.476,与阴性对照差值为1.407,
TRAP－银染色呈现特征性间隔6bp的梯形条带。原位杂交结果显示SMMC－7721细胞胞浆呈现紫蓝色杂交信号，呈弥漫全浆型；RT-PCR显示145bp的扩增条带。
三、p53基因转染鉴定：RT－PCR结果显示与转染空载质粒相比，wt-p53转染24h、48h、72h
p53mRNA表达明显增多。
四、转染后细胞端粒酶活性、hTERTmRNA表达：与转染空载相比，转染wt-p53后24h端粒酶活性轻度抑制，450nm处吸收值为0.926, 抑制率为11.47%，48h、72h端粒酶活性明显抑制，抑制率分别为50.27%、59.1%(图6)
TRAP-银染色显示间隔6bp的梯形条带依次减弱甚而消失。与转染空载质粒相比，wt-p53转染后24h hTERT mRNA表达已明显抑制，48h、72h表达完全受抑。
五、bcl-2蛋白表达：与转染空载质粒相比，转染p53细胞bcl-2蛋白表达减少。
六、 细胞凋亡检测：p53基因转染后24h流式细胞仪即检出明显的凋亡峰，而空载转染未见相应凋亡峰。
讨 论
SMMC-7721是国内建株多年的人肝癌细胞[5]，卫立辛[6]等曾报道其端粒酶活性阳性，我们用PCR-ELISA和TRAP-银染法都得到与卫氏相同的结果。此外我们应用原位杂交和RT-PCR法还发现该细胞同时也是hTERT阳性表达株。SMMC-7721人肝癌细胞端粒酶活性和hTERTmRNA表达的确定再次证明肿瘤细胞与端粒酶/
hTERT的密切关系。
研究已经表明端粒酶/hTERT活化表达参与肿瘤包括HCC的发生发展过程，但其调控机制不清。近年有研究结果提示肿瘤抑制基因p53可能参与端粒酶/hTERT的活化表达调控过程，但目前研究尚存在分歧。Kusumoto[9]、Kanaya[11]最近的研究结果显示外源wt-p53的诱导表达可抑制胰腺癌细胞中端粒酶活性和hTERT表达，在此之前，Maxwell[11]的研究却表明转染外源wt-p53对端粒酶活性无影响作用。HCC是我国常见致死的恶性肿瘤之一，有关端粒酶、p53在HCC中相互作用的体外研究尚未见报道。我们选择国内建株多年的人肝癌细胞进行实验，结果表明将外源wt-p53导入端粒酶/hTERT阳性的人肝癌细胞中，其端粒酶活性、hTERTmRNA表达均明显受抑制，同时流式细胞仪检测到凋亡改变。结合我们在人体材料的研究[4],
提示p53基因途径参与了HCC中端粒酶/hTERTmRNA活化表达的调节过程。我们结果还显示 p53基因转染后细胞端粒酶活性抑制同时，细胞呈现凋亡同时、bcl-2蛋白表达下调，推测bcl-2可能参与p53对端粒酶活性、hTERT表达的影响过程，其详细机制尚待深入研究。
参考文献
1 Meyersib M,
Counter CM, Eaton EN, et al. HEST2, the putative human telomerase catalytic
subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization. Cell，1997:785-795
2 KimNW,
Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific associaton of human telomerase
activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, 266: 2011-2015
3 Holistein
M, Sidransky D, Vogelstein B, et al. P53 mutations in human cancers. Science,
1991, 253: 49-53
4 戴大英，翟为容，朱腾方，等. 肝细胞癌中端粒酶逆转录酶表达及其与肿瘤抑制基因p53相关性研究.中华肝脏病杂志，2001，9（Supple）：79-81
5 董荣春、周荣华、吕发度，et al. SMMC-7721人肝癌细胞株的建立及其生物学特性的初步观察. 第二军医大学学报，1980，1：5-9
6 卫立辛，
吴孟超，陈汉,等. 银染的端粒重复序列扩增法检测人细胞端粒酶活性的研究. 第二军医大学学报,1998, 19(1): 26-28
7 Nakamura
TM, Morin GB, Chapman KB, et al. Telomerase catalytic subunit homologs from
fission yeast and human. Science(Washington DC), 1997, 277: 955-959
8 Shinya K. Takami
A, Kazuhisa S, et al. Evaluation of biological responses to polymeric
biomaterials by RT-PCR analysis IV: study of c-myc, c-fos and p53mRNA
expression. Biomaterials 2000, 21: 521-527
9 Kusumoto M,
Ogawa T, Mizumoto K, et al. Adenovirus-mediated p53 gene transduction inhibits
telomerase activity independent of its effects on cell cycle arrest and
apoptosis in human pancreatic cancer cells. Clinical cancer research,
1999,5:2140-2147
10 Kanaya T,
Satoru Kyo, Hamda K, et al. Adenoviral expression of p53 represses telomerase
activity through down-regulation of human telomerase reverse transcript
transcript.Clinical cancer research, 2000, 6: 1239-1247
11 Maxwell SA, Capp D, Acosta SA, et al. Telomerase activity in immortalized ednothelial cells undergong p53-mediated apoptosis. Biochem. Biophys, Res. Commun, 1997, 241: 642-64511
作者单位：1.复旦大学医学院病理教研室[戴大英（现在上海同济大学附属同济医院病理科）
翟为溶 朱腾方 朱虹光] 上海 200032；2. 上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室 上海 200032
通信作者：翟为溶 Email :wrzhai@online.sh.cn